加州大学生物3D打印GelMA基血管化皮肤

皮肤提供了一种生理屏障，可以保护内脏免受温度变化、机械冲击、各种微生物和化学物质的影响。它由三个主要成分组成:表皮，真皮和皮下组织。(1)表皮含有4 ~ 5层上皮细胞，可形成角质化的复层鳞状上皮；(2)真皮由真皮成纤维细胞(DFs)产生的胶原和弹性蛋白纤维相互连接的网状结构组成，真皮内的血液和淋巴管为皮肤提供营养，并与真皮成纤维细胞相互作用；(3)皮下组织血管分布良好，主要由脂肪、血管和神经组成。这些不同的皮层提供了独特的微环境，其中每一层都可以直接或间接地与其他层沟通，从而实现其特殊功能。因此，拥有一个可复制的皮肤组织模型不仅有助于可靠地预测人类皮肤的功能反应，而且有可能在不久的将来开发出个性化的皮肤相关疾病模型。

近期，加州大学的Ali Khademhosseini教授团队在Biofabrication杂志上发表的题为“Biofabrication of endothelial cell, dermal fibroblast, and multilayered keratinocyte layers for skin tissue engineering”的文章，作者使用基于生物医学的方法和生物工程技术开发了一个具有内皮细胞网络、真皮成纤维细胞和多层角质细胞的三维皮肤组织模型。

作者提出构建三维皮肤组织模型的思路：(1)在具有0.4μm孔径的聚酯多孔膜上打印载有HUVECs的GelMA/海藻酸盐水凝胶，该结构有利于真皮成纤维细胞与内皮细胞的相互作用以及促进营养物的扩散(形成内部血管网络)；(2)打印封装有人真皮成纤维细胞的GelMA水凝胶，通过调节基质硬度影响细胞的生长和功能；(3)通过多次在真皮层上方铺覆包裹有角质细胞的明胶形成多层的表皮明胶涂层。

图1 皮肤组织每层结构的示意图
为了实现上述构想，作者首先将具有生物相容性的GelMA/海藻酸盐水凝胶混合HUVECs并3D打印到多孔膜上，并检测生物墨水的可打印性、凝胶性和对细胞活力的影响，并确定了合适的GelMA/海藻酸盐水凝胶配比。

图2 3D打印内皮细胞层
然后，在室温下通过流变性测试和模量测试测量光交联前后不同生物墨水的粘度和压缩模量。实验结果表明，随着海藻酸盐浓度的增加，交联生物墨水的流变性能和压缩模量变大。随后，为了检验3D生物墨水的生物相容性，在培养的第1、4、7天对HUVECs的存活率进行了评估。细胞培养在柔软的水凝胶中时表现出了更高水平的生存能力。基于上述结果，7.5% GelMA/2%海藻酸配方被选为HUVECs生物打印的生物墨水。

图3 GelMA基水凝胶的粘性、压缩模量和生物兼容性测试
由于基质硬度在调节细胞功能中起着关键作用，作者分别评估了5%、7.5%和10% GelMA水凝胶的流变性能、压缩模量和人真皮成纤维细胞的生存能力，以确定设计真皮层的最佳凝胶浓度。结果表明，凝胶的流变模量和压缩模量随着凝胶浓度的增加而增加，而无论凝胶的浓度如何均显示出良好的生物相容性。

图4 机械性能可调节的GelMA水凝胶用于构建3D真皮层
之后，作者发现在浓度为7.5%的GelMA水凝胶中人真皮成纤维细胞具有更高的增殖和扩散能力。此外，在浓度为7.5%的GelMA水凝胶中人真皮成纤维细胞具有更高的I型胶原酶原的分泌能力和更低的I型金属蛋白酶的分泌能力，表明该环境下人真皮成纤维细胞能形成更具有弹性和强度的皮肤组织。

图5 真皮层细胞活性及功能鉴定
最后，作者将人角质细胞接种于真皮层上，然后将含1%的生长培养基的明胶覆盖在角质细胞上并重复多次。结果表明，每层的人角质细胞都具有很高的存活能力，通过该方法可以在短时间内简单地得到约137μm厚的表皮层。

图6 多层角质细胞构建表皮层
为了可视化皮肤模型中不同的细胞层，作者在细胞播种前分别用蓝、红、绿对HUVECs、人真皮成纤维细胞和人角质细胞进行了标记。横切面图像显示，构建的皮肤组织在每一层表现出良好的层次结构。在本研究中，作者提供了一种简单的方法，利用生物医学方法和生物工程技术来优化皮肤组织的每一层。构建出的3D皮肤组织作为一个多功能平台，使体外皮肤模型的重建成为可能。

图7 3D生物制造皮肤组织模型