AFM综述:骨组织工程中支架制造技术及其结构/功能特性

摘要：骨组织工程学（BTE）是一个快速发展的领域，旨在创建可以在体内整合和降解以治疗患病或受损组织的生物功能组织。支架制造技术在决定植入的生物材料的最终结构，机械性能和生物学响应方面非常重要。本文提供了有关支架制造技术，BTE的结构和功能特性的最新成就的全面综述。提出了从无机生物材料到天然和合成聚合物以及用于支架加工的相关复合材料的不同类型的生物材料。还讨论了新兴的支架技术，例如静电纺丝，冷冻干燥，生物打印和脱细胞。
引言
组织工程旨在开发新的生物功能组织，以再生和修复受损或患病的组织。2017年，全球骨科手术总数约为2230万，预计到2022年将达到2830万。患病或受损的骨组织目前对移植的骨替代品有巨大需求，是每年第二大移植组织。通常，直接使用患者或相容供体的骨组织进行骨修复。由于周围组织供应不足，供体部位发病率和不相容性，这些治疗方法仅限于较小尺寸的缺陷。为了克服这些限制，仿生支架的制造是不断增长的关注领域。骨组织工程(BTE)策略(图1)显示出有希望替代更传统的骨移植方法（例如自体移植或同种异体移植）来替代丢失或受损的骨组织。
 

图1

几种支架制造技术处于组织工程学（TE）的最前沿，例如静电纺丝，冷冻干燥，生物打印和脱细胞化。结合这些制造方法，已经为BTE选择了广泛的材料。该选择通常基于骨骼组织的功能和生物学要求，骨骼本身是由无机和天然成分组成的复合材料，以高度分层的方式组织。由于生物分子具有与生长中的细胞相互作用的固有能力和易于化学修饰的特性，最近人们的思维已从生物惰性材料转向生物活性材料，专注于天然存在的生物聚合物。近来，衍生自脱细胞的细胞外基质的生物材料也已用于BTE支架中。去细胞的骨细胞外基质（ECM）保持天然的基质结构，生长因子和细胞因子，从而增强细胞活力和生长，以进行组织修复和再生。

尽管最近对此主题进行了大量研究，但BTE的制造方法和不同生物材料的选择仍基于假设，没有明确的前进方向。BTE一直以往评价着眼于生物材料的主体，的制造技术，和结构设计。但是，本文的重点是评估骨棚架的制造方法，同时对高性能骨组织植入物的最佳未来制造路线提供了评论。应特别注意将支架结构/性质/加工关系映射到生物学功能，以及如何通过同时进行的血管形成，免疫调节和成骨进展来增强临床结果。

第一部分通常定义TE，尤其是BTE。第二部分和第三部分简要概述了可用于BTE的多种生物材料和支架制造技术。第四部分和第五部分对骨组织工程的支架结构/性能/功能关系进行了严格而全面的评估，同时对高性能骨组织植入物的最佳未来发展路线提供了评论。接下来是与血管化，免疫调节和成骨有关的最新最新进展的讨论。最后，我们提供了对未来的展望，同时强调了结构/属性/功能关系在优化BTE临床结果中的重要性。

骨组织工程用生物材料

骨是一种高度组织化的复合材料，包含50-70％的无机成分(主要是羟基磷灰石(HAp)，20-40％的有机成分(主要是I型胶原)，5-10％的水和3％的脂质。在宏观上，骨骼可分为外层硬质皮质骨和海绵状小梁骨。成骨细胞以类骨质的形式促进新骨的形成，其由胶原蛋白和其他蛋白质组成。图2说明了这些材料在骨骼结构内的分布情况。

图2

材料及其降解产物的生物相容性也是BTE中的重要考虑因素。支架应允许细胞附着，增殖和分化，同时无细胞毒性并引起最小的免疫反应。对于BTE，生物活性涵盖两个主要的生物过程：i）骨传导性和ii）骨传导性。骨传导性支架促进骨骼在非骨质部位的材料表面沉积，而骨诱导性支架则利用未成熟的干细胞并将其分化方向导向成骨细胞（例如成骨细胞）。

已经研究了多种生物材料用于骨移植支架，即无机生物材料，其中包括金属（例如钛及其合金）和生物陶瓷（例如磷酸钙（例如HAp和α，β-磷酸三钙[α，β]） ‐TCP]），碳酸钙，生物活性玻璃和玻璃陶瓷，氧化铝和氧化锆）以及多种天然（例如胶原蛋白，明胶，丝蛋白[SF]，壳聚糖，透明质酸[HA]，结冷胶[ GG]及其衍生物，藻酸盐和合成聚合物（例如聚氨酯[PU]和聚己内酯[PCL]）及其组合（表 1）。生物陶瓷以其出色的生物相容性，骨传导性和生物吸收性而闻名。聚合物具有较高的机械强度和刚度，并且天然聚合物具有诸如生物相容性和ECM相似性等优点。

表1. BTE中常用的生物材料的一般属性

在诸如3D生物打印之类的制造过程中，或者在预制支架上播种细胞的过程中，在制造的支架中包含细胞是制造过程中的关键步骤。预制支架通常涂有ECM衍生的凝胶或类似ECM的凝胶，以增强生物相容性并促进细胞播种。

植入的生物材料应在植入时提供足够的机械稳定性，同时引起非免疫原性反应，因为生物材料会随着天然组织的生长同时降解。生物材料还应促进附近干细胞以及成骨细胞的增殖和浸润。生物材料的选择取决于机械性能与天然骨组织的机械性能的接近程度。例如，皮质骨的弹性模量为14-20 GPa，而生物活性玻璃45S5生物玻璃的弹性模量据报道为35 GPa，而PGA达到7 GPa，天然生物聚合物胶原原纤维≈35MPa。因此，BTE通常选择具有较高刚度范围的热塑性聚合物和多孔生物陶瓷，因为它们可以模仿骨骼组织再生所需的承重性质。BTE中使用的最有希望的无机生物材料，天然和合成聚合物描述如下。

2.1 无机生物材料

无机生物材料（例如金属和生物陶瓷）已被广泛用于修复和再生患病和受损的骨骼。这种类型的生物材料特别应用于骨移植物和水泥，骨科承重涂层（髋臼杯）和牙周修复。

钛及其合金等金属生物材料的特点是强度高，弹性模量低和密度低，而生物陶瓷具有出色的生物相容性，骨传导性和耐腐蚀性。此外，生物陶瓷的压缩强度是拉伸强度的十倍。

在生物陶瓷中，磷酸钙（HAp和TCP）由于与天然骨骼的矿物结构相似而长期使用。TCP，无论是β还是α形式，都具有很高的吸收速率，从而形成了可吸收的网络，而HAp在生理条件下是最稳定的相。这些材料在承重应用中具有有限的机械强度，可以通过将它们与聚合物结合来克服。此外，这种陶瓷可以很容易地掺入几种生物活性离子，信号分子和细胞。

氧化铝和氧化锆由于其化学生物惰性，高强度，硬度，抗裂性和耐腐蚀性，是成功用于整形外科领域的其他类型的陶瓷，尤其是用于全髋/膝关节置换术的陶瓷。通过结合氧化锆和氧化铝作为复合材料（称为氧化锆增韧氧化铝[ZTA]），可以改善低的断裂韧性，耐磨性，和氧化铝陶瓷的降解的低敏感性，从而降低冲击和位错的危险，并提高了稳定性。

生物活性玻璃通常用于骨骼再生，与其他生物陶瓷相比，其具有更快的结合结缔组织的能力，在植入时形成无定形磷酸钙或HAp层。此外，硅，钙，磷，和Na离子从硅酸盐玻璃的溶解期间释放能刺激骨生成和新血管形成/血管生成，和酶促活性。

2.2 天然生物聚合物

天然生物聚合物与合成聚合物相比，尤其具有优势，因为它们与ECM具有相似性，生物相容性和生物降解性。生物聚合物主要研究了BTE是蛋白质（例如，胶原，明胶和SF）和多糖（例如，脱乙酰壳多糖，透明质酸，GG，和藻酸盐）。经常单独或与化学修饰结合使用各种交联策略以提供对支架刚度和结构的控制。这些将在下面的第3.3节中进一步讨论。

胶原蛋白和明胶具有相似的物理性能，并因其出色的生物降解性，生物相容性和免疫原性而广泛用于生物医学应用。胶原蛋白是人体蛋白质的三分之一，是骨骼组织中含量最高的聚合物。超过29种类型的胶原蛋白已被记录下来，由于其具有组织形成和细胞生长的能力，因此被广泛应用于组织工程。在不同类型的胶原蛋白中，I型在骨组织中最普遍，而II型主要在软骨中发现。近来，源自海洋的胶原蛋白作为哺乳动物胶原蛋白的替代物也引起了人们的关注，因为它的生产成本低并且易于从可利用的海洋废弃物中提取。

明胶是一种天然的水溶性蛋白质，是通过酶处理从不溶性动物胶原蛋白中衍生而来的。明胶有两种类型：通过酸处理产生的A型，和用碱性或高pH值溶液处理的B型。包含明胶的纳米纤维支架主要用于大骨缺损的修复。许多原因认为明胶是BTE的合适生物材料，包括：i）生物相容性和生物降解性；ii）弹性；iii）与亲本蛋白质相比，抗原性较低；iv）优异的细胞粘附性，和v）允许化学修饰的可及官能团。它也有凝胶的形成，乳化剂，发泡剂，和增稠剂，从胶原类型，源，和变性过程取决于容量。此外，明胶有效地与天然和合成聚合物共混，可促进支架的高生物亲和力和生物力学性能。

从家蚕，桑蚕丝和非桑蚕丝以及蜘蛛获得的蚕丝已成为组织工程学中最受研究的领域。桑蚕双歧杆菌特别感兴趣，它是一种具有半结晶结构的纤维蛋白，具有良好的机械强度和刚度，高生物相容性，弹性和缓慢的降解性。SF由两个主要的晶体结构组成：i）由α-螺旋和β-折叠构型交替形成的丝I，和ii）属于反平行β-折叠结构的丝II，其有助于SF的刚度和强度。基于SF的支架的制造取决于SF的晶体/非晶结构的控制，以获得更好的机械强度，降解性和水可加工性。

HA主要存在于结缔组织和滑液中，并且具有生物降解性，生物相容性和粘弹性的特点。尽管如此，HA的机械强度有限，可以通过化学改性或交联来解决。

壳聚糖是从所获得的Ñ甲壳素-deacetylation，并且由d -葡糖胺（脱乙酰单元）和Ñ乙酰基d -葡糖胺（乙酰化单元）随机分布在聚合物内，并且由β-（1-4）连接的-糖苷键。它具有聚电解质和阳离子性质，良好的生物降解性，抗血栓形成和止血作用，粘膜粘附，止痛作用和抗真菌活性。GG是水溶性的高分子胞外多糖，得自Sphingomonas elodea(原名Pseudomonas elodea)）。它具有生物相容性，热响应性，出色的强度和稳定性，通常用作胶凝剂。GG可以以低酰基和高酰基形式获得，其中低酰基GG形成坚硬，非弹性和脆性的凝胶，而高酰基形式则生成柔软，弹性和挠性的凝胶。通常在褐藻细胞壁中发现的藻酸盐被视为具有吸水能力的胶凝剂和增粘剂。可通过将藻酸盐与不同的生物活性分子结合来调节其胶凝，生物相容性，生物降解性和机械强度。

2.3 合成聚合物

使用可生物降解的合成聚合物的主要动机与它们非常高的强度和刚度有关，这是骨骼修复/再生所必需的。这种聚合物的一个关注点是它们会经历整体腐蚀过程，从而导致支架过早失效，甚至突然释放酸性降解产物，从而引发强烈的炎症反应。但是，可以控制分子量，化学组成和结晶度以控制降解速度。聚α羟基酸，如聚乳酸，聚乙醇酸(PGA)，聚乳酸-共乙醇酸(PLGA)共聚物和聚PCL是BTE中最常用的可生物降解的聚合物，部分原因是它们具有自我增强的能力，可以最终获得更好的强度。当与生物陶瓷结合生物可降解聚合物通常显示较少的炎症反应。
 

PLA具有热稳定性，细胞相容性和无毒降解产物的特点。它存在于不同的形式，如聚-升-丙交酯酸（PLLA）和聚- d -丙交酯酸（PDLA），其中L / d比可以以优化的材料的降解速率进行调整。PLGA是PGA和PLA的组合，是FDA批准的聚合物，具有非常好的生物相容性，生物降解性和可调的机械性能。PCL也已获得FDA批准用于骨修复，其特点是具有良好的溶解性，低熔点和出色的共混物相容性。与PLA和PGA相比，它具有良好的机械性能，并且易于加工。特别地，由于其缓慢的降解速度，它对于长期的可植入设备的开发非常有用。聚酯键的降解主要由酯键的非酶水解决定，因此，由于其较高的疏水性，PCL可能需要3-4年才能完全降解，而PGA的降解时间为1.5-3个月，而PLLA的降解时间为6-24个月。然而，其疏水性不利于细胞附着和渗透，可以通过与不同的生物陶瓷和生物聚合物涂层结合来解决。

2.4 无机-有机复合生物材料

无机-有机复合材料是模仿骨骼组织的好策略，而骨骼组织本身就是天然复合材料，其机械和生物学性能明显优于单一组分。无机材料和聚合物材料之间的最佳比例对于诱导骨组织形成，同时保持复合材料的孔隙率和机械强度至关重要。各种各样的不同组合产生了对BTE具有非常好的性能的复合材料。例如，使用SF结合β-TCP呈现高的孔互连性，细胞附着和增殖，以及在足够用于BTE体内响应。另一项研究表明，双相磷酸钙（BCP）和胶原蛋白的结合比单独的BCP导致更高的新骨形成。此外，该作者报告说，复合物中较高的HAp：β-TCP比例对新骨形成有积极影响。例如，无机纳米颗粒也已经被掺入到聚合物基质中以优化其物理和机械性能。

3种支架的制作方法

已经开发了用于组织工程的一系列处理技术，因此，已将其应用于BTE(表 2)。理想地，最佳的制造技术可以生产具有可控的多层多孔结构的可重复支架，因为孔结构的几何形状对骨骼组织的机械和生物学反应都具有深远的影响。如今，可以促进细胞和生长因子融合的制造技术对于创造最佳支架非常流行。可以肯定的是，对于特殊的临床需求，需要先进的加工技术来促进针对患者特定植入物的高度可定制的支架几何形状的生产。生产骨组织支架的当前方法可包括：i）静电纺丝，ii）冷冻干燥，iii）3D打印或增材制造（AM），iv）相分离，v）气体发泡和vi）颗粒浸出（表 2）。这些技术中的一些可以细分为其他子类别，例如AM可以细分为熔融沉积建模（FDM），直接墨水书写（DIW），立体光刻（SLA），数字光处理（DLP）和选择性激光烧结（SLS）。

表2. BTE的典型制造方法的描述，特性，生物材料，孔隙率和结构/处理

未来讨论三种最有希望的技术的功能和操作方法。

3.1 电纺

电纺涉及一个过程，在该过程中，由于静电力的作用，处于粘性状态或溶液状态的带电聚合物流被吸入纤维中。基本的静电纺丝设备包括四个主要部分：i）注射泵，ii）电源，iii）金属针以使电流进入聚合物溶液，iv）金属收集器以收集纤维。通常通过将喷丝头和纤维收集器连接至相对端的电端子来形成支架。端子之间的电势差导致材料被抽出并沉积到收集器上，这有助于纳米级纤维的制造。胶原蛋白和具有高孔隙率的具有高表面积的纳米纤维明胶典型地通过静电处理。

3.2 冷冻干燥

冷冻干燥或冻干是基于聚合物溶液的干燥。它可以分为三个步骤：i）溶液制备，ii）溶液的浇铸或模制，iii）低压冷冻和干燥。在第三步中，通过升华和解吸分别提取冰和未冻结的水。冷冻干燥能够生产出孔隙率约为90％，孔径范围为20至200 μm的支架。孔的大小由冻结速率，聚合物浓度和温度控制。为了生产具有高孔隙率和互连性的支架，需要高强度的真空。

3.3 生物打印

生物打印技术的独特之处在于，它可以通过计算机辅助设计（CAD）软件生成的3D数字模型创建复杂的，可定制的分层几何图形。这项新兴技术能够产生具有可控结构和孔隙率，可调整的结构和机械性能的几何形状，同时又可重现且具有成本效益。此外，可以将细胞，生物活性分子和/或药物掺入结构中以产生更好的细胞反应。多种天然和合成聚合物，生物陶瓷及其组合已用于生产生物墨水，而胶原蛋白及其衍生物是最常用于充满细胞的溶液。

生物打印可以分为以下步骤：i）预处理；ii）加工；iii）后处理。预处理是指通过计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）扫描对目标组织的解剖结构进行成像，并将这些图像转换为切片的3D模型。加工步骤涵盖了生物打印组织生产中涉及的所有内容，即生物墨水的开发和支架的制造。后处理是指生物打印组织的成熟直至适合于体内使用，通常发生在生物反应器中。

对于可印刷的生物墨水，应考虑几个要求，例如流变行为（粘度和剪切稀化），表面张力，溶胀，胶凝动力学和材料的机械性能。另一个重要的方面是在加工和后加工步骤中生物墨水的交联（物理，化学或酶促），以保持印刷结构的生物力学稳定性。物理交联取决于温度和分子相互作用以产生非共价键和有机自由基物质。物理交联的例子是使用二价离子（例如，Ca 2 +，Ba 2+和Mg 2+）来交联藻酸盐。化学交联是由聚合物链之间的共价键的形成而获得，并且更稳定，比物理交联更强。戊二醛（GTA），1-乙基-3- [3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）和1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDGE）是最常见的聚合物官能团交联剂（例如， COOH， OH，或 NH 2）。酶促交联还可以促进基于蛋白质的聚合物之间的共价键合，并在生理条件下快速胶凝（不超过10分钟）。多种酶已用于原位凝胶化，例如转谷氨酰胺酶，分选酶，赖氨酰氧化酶，血浆胺氧化酶，磷酸泛肽基转移酶，磷酸酶，β-内酰胺酶，嗜热菌素和过氧化物酶。其中，辣根过氧化物酶（HRP）具有用于生物医学领域中特别关注，因为它的快速凝胶化和可控的交联密度。HRP在氧化剂（例如过氧化氢(H 2 O 2))存在下催化苯胺，苯酚和酪胺的偶联。一个例子是HRP / H 2 O 2当与弹性蛋白结合时，SF的交联被提议作为用于水凝胶生物打印的快速固化生物墨水。生物聚合物的甲基丙烯酸酯化是另一种广泛应用于定制其机械和生物功能性的化学修饰。例如，在光引发剂的存在下，明胶与甲基丙烯酸酐的反应衍生出甲基丙烯酸明胶（GelMA）。

在基于支架的（自上而下的方法）生物打印中，将打印外源性生物材料基质（例如水凝胶），并将细胞接种或作为生物墨水的一部分进行打印。自上而下的打印方法通常用于骨骼组织，因为它们很可能实现骨骼所需的结构和机械性能。SLA，SLS和FDM是BTE中使用最普遍的生物打印形式。为了克服诸如细胞接种效率低和细胞分布不足的挑战，经常使用将再生细胞封装在外部基质内的仿生水凝胶。这些水凝胶已显示出满足细胞活力，细胞锚定，细胞递送以及持续释放生长因子的化学线索的需求的有前途的能力。细胞印刷通常采用无支架（自下而上）的方法，该方法依靠细胞聚集体通过自主自组装融合在一起。用于细胞打印的技术包括基于液滴的生物打印（适用于DIW），基于挤出的生物打印（适用于FDM）和激光辅助生物打印。当前的生物打印技术主要由单组分生物墨水主导，这种墨水通常在细胞活力和打印机可加工性之间缺乏可接受的折衷。这些技术不适用于印刷大型骨支架，但不适用于具有高细胞密度的较小组织。有趣的是，已经探索出混合方法，该方法在同时解决机械和生物学功能方面显示出可喜的成就。

3.4 脱细胞

脱细胞骨基质（DBM）已广泛用于BTE中，作为支架和生物制造用生物墨水，旨在模仿天然骨微环境。去细胞化包括从组织中去除所有细胞，同时保留天然ECM组成及其结构完整性，以及促进细胞生长和分化的能力。获得DBM的加工技术包括表面活性剂和酶促方法（例如乙二胺四乙酸与胰蛋白酶或十二烷基硫酸钠（SDS）与氢氧化铵，Triton X-100和脱氧胆酸钠以及核酸酶和蛋白酶的组合），以及热冲击，超声处理和静水压力。后者的优点是无有害化学物质的使用和蛋白质变性的最小化，因此可以保留高水平的ECM含量。最终步骤涉及使用核酸酶和脱水酒精彻底清除细胞残留物。通过测量DNA含量和细胞核染色可确认脱细胞作用。

基于DBM的支架可以单独使用DBM制成，也可以与多种聚合物和生物陶瓷组合使用，以增强其机械性能，成骨作用和血管形成潜力。

骨组织工程中的支架结构/功能特性
 

骨组织结构是BTE中的关键特征，因为结构会影响机械性能和生物学响应。在执行天然骨骼的承重功能时，支架还应促进血管形成。支架的互连多孔结构（图 3）允许天然细胞迁移和增殖。此外，最佳设计应为细胞-支架相互作用提供足够的表面积，同时促进氧气和营养物的扩散以及废物的排出。

图3

通常，需要孔径≥300μm以促进新的骨形成和血管形成，而可接受的最小尺寸为≈100μm。由于提供足够的氧气和营养供应空间，较大的孔径被证明是骨骼生长的最佳选择，这进一步促进了新骨组织中的血管形成。通常，BTE支架的孔径在50至> 900 μm的范围内。已显示大孔可通过介导血管形成来促进骨诱导性。但是，小于100 μm的孔径可能会阻止血管生成。550 μm的平均孔径已被证明是最理想的骨形成方法，而分层的多孔结构已被证明可以增强生物学特性。渗流理论，如图3A所示 ，用于计算可以穿越支架相互连接的孔的最大示踪剂的直径。渗滤直径对于理解支架的互连至关重要，因为它限制了可以通过支架的细胞和营养物质的大小。在另一侧，瓶颈尺寸由图3B中的括号指示 ，描述孔之间连接的直径。一项体内研究表明，骨替代物的最佳孔/瓶颈尺寸为700-1200 μm，因此可以通过印刷技术进行控制。

组织工程化的骨骼需要具有足够的抗压强度以支撑体重。通常，小梁骨和皮质骨的压缩模量分别高达2.0 GPa和14-18 GPa。另一方面，制成的支架的弹性模量也必须足够高，以在体内维持其结构并促进细胞生长。支架的降解率必须与天然ECM的增长相匹配，以确保在支架的整个生命周期中都具有机械支撑。这在很大程度上取决于流体的进入速率，而流体的进入速率又是孔隙率的函数。因此，增加的孔隙率以降低的机械性能为代价，对支架的降解产生了积极的影响。骨组织支架的孔隙率与抗压强度之间的典型反比关系如图 4所示。孔的互连性，孔径形状在制造用于骨组织修复的理想支架中起着重要作用。考虑到组织修复率会随着年龄的增长而降低，因此应仔细考虑支架的结构设计和材料选择。

图4

生物打印的骨支架可以制造具有受控的物理和机械性能的工程组织，可以结合多种生物墨水的打印以及在不同的层和渐变中进行打印。例如，机械强度高的“松质骨状”可印刷植入物，含有包封在PLGA微粒干细胞和编程因子控释，帮助的新颖局部递送策略的发展直接用于骨细胞行为修理。

关于基于dECM的BTE支架的使用，已经报道了具有指导性生物分子且免疫反应降低的理想微环境。例如，体外研究表明，培养21天后，大鼠BMSC在PCL /脱细胞牛小肠粘膜下层/ HAp多层支架上沿成骨细胞谱系增殖和分化，同时保持了机械性能。与这些研究平行的是，基于dBM的支架的生物打印已受到相当多的关注，表明精确的孔径和微孔可以调节血管的浸润，从而导致新的骨形成以及增强的机械稳定性。

骨骼组织工程中的5种支架结构/加工关系

结构的控制最终控制了机械性能，并在较小程度上控制了生物学响应。因此，评估哪种制造方法可以提供对结构的最大控制以模仿天然组织至关重要。尽管支架结构的关键方面（包括孔径，形状，方向和互连性）是通过加工方法的空间分辨率和几何控制直接确定的，但它们却受到加工时间，交联机制和热降解的间接影响。例如，胶凝速率对于设定合适的印刷速度至关重要，以确保在整个加工过程和后加工过程中保持支架的刚度，因此需要在印刷之前通过检查其化学，物理或酶促交联机理来分析生物墨水的胶凝。

而表 2提供了对当前最先进制造技术的洞察力，这并不一定为以下问题提供简单的答案-哪种技术将成为BTE的主导？例如，空间分辨率本质上与机械和生物学特性相关联，因此是关键因素，但这需要在特定背景下加以考虑。与增材制造方法相比，可通过喷墨生物打印适用于大型骨骼构造的陶瓷支架获得更高的分辨率（约15 μm），但是该技术因其与细胞印刷不兼容而受到限制。另一个例子是，皮质骨的孔隙率通常仅为5-10％，而松质骨的孔隙率则为50-90％，因此，适用的技术必须促进在这些范围内产生孔隙。

迄今为止，尚无加工技术能够构建与天然骨组织相同的体系结构，但是随着先进医疗材料的发展，这种技术将发生改变，这种材料可促进微挤压而不会堵塞喷嘴，从而提供高水平的空间分辨率。其他加工问题和局限性可能会通过结合技术来解决，例如AM，可以与颗粒浸出或冷冻干燥相结合，以克服基于材料或结构的局限性。

5.1 临床试验

值得注意的是，尚未为BTE建立最佳的生物材料，因此跨制造技术的比较仍然缺乏跨最佳骨组织材料进行类似比较的优点。迄今为止，有限的骨组织支架已经进入临床应用，尽管这未能提供对结构-加工关系的关键见解，但它为选择最佳材料提供了有意义的背景。Zeng等综述了修复骨缺损的临床试验研究，其中八种使用天然支架（胶原蛋白和明胶），十二种使用合成支架。据报道，将支架与骨刺激剂结合使用可加速骨愈合，其中HAp /胶原蛋白显示出最高的骨再生水平。在少数临床可用产品中，由天然生物聚合物（胶原蛋白和明胶）以及无机添加剂（例如TCP和HAp）组成的复合材料往往会主导市场。

5.2 层次结构

如图 5所示，由于骨骼再生是通过细胞和支架的协同作用进行的，因此BTE中的许多研究都采用了模仿骨骼组织的分层孔结构的策略。使用间接3D打印和冷冻干燥的组合方法，创建了由SF和生物活性玻璃组成的分层3D生物活性支架，该支架表现出两个级别的孔，分别为500–600和10–50 μm。这产生了极好的机械稳定性和柔韧性，分层多孔支架在潮湿条件下压缩加载后没有任何波动。此外，与普通SF支架相比，生物复合支架促进了人类骨髓干细胞的附着以及碱性磷酸酶（ALP）活性，从而突出了BTE应用中分层结构的希望。

图5

更好地模仿天然骨组织的复杂形态倾向于具有更大的机械性能。例如，PCL/ PLGA支架对于不同的支架形态表现出不同的杨氏模量：对角线（9.81 MPa），交错（7.43 MPa）和晶格（6.05 MPa）。较少报道的结构特征是孔定向，该特征对机械性能具有明显和可测量的影响。已对通过顺序单向冷冻制备的壳聚糖和明胶（B型）支架进行了检查。已经发现，基于孔隙取向，压缩模量，拉伸模量和剪切模量都显示出相同的趋势，即垂直>随机取向>水平。这进一步增加了对加工技术的推测，该加工技术可以产生具有与天然骨组织的取向对准的受控的孔取向的支架。这些工作集中于将AM与其他传统的组织工程方法（例如气体发泡）相结合，这些方法表明可以同时实现孔隙率和几何控制。

Kim等使用3D打印和盐浸相结合的方法，制造了孔径（宏观和微观）不同的磷酸镁（MgP）陶瓷支架，并研究了兔颅盖模型的体内反应。创建了三种类型的支架，所有支架都存在大孔（> 100 um），但微孔水平不同（图 6A）。含有微孔的MgP支架显示出较高孔隙率的层状形态（图 6B），与MgP0（图6C）相比，它促进了更快的生物降解，似乎增强了骨骼的形成和重塑活动 。

图6

刘等报告了在成年兔的血管形成不同的孔的水平，使用聚（3-羟基丁酸酯的冲击共-3-羟基己酸酯）（PHBHHx）支架制造由合并的溶剂浇铸和颗粒沥滤方法。虽然先前的研究主要是从宏观和微观的角度研究多孔结构，但Liu等人。证明了介孔材料（2-50 nm）具有以下能力：i）刺激HAp的形成，ii）促进成骨细胞的增殖和分化，iii）增强骨基质界面强度。此外，介孔材料的加入有利于传递生长因子，例如BMP-2，并促进血管生成，从而进一步增强了骨的再生，如图7所示。

图7

尽管本综述中介绍的大多数制造技术都能够产生微孔和大孔的组合，但仍需要提高空间分辨率和精度才能始终如一地产生高度受控的中孔。郑等。演示了近净成形制造方法金属注射成型（MIM）在钛植入物制造中的应用。这有助于精确表示天然骨组织的多孔结构，直至中孔水平，并且已证明在体内成骨犬模型中是有益的。尽管用于长期植入的作为生物稳定和生物惰性材料的钛在本次审查中超出了范围，但该制造技术仍可提供对BTE中精确控制结构的好处的见解。

改善骨骼组织工程中支架血管化的6种先进策略

血管化是BTE中最关键的挑战，因为组织厚度限制了营养和氧气扩散，这是在骨愈合和再生过程中支持骨整合和成骨作用所必需的（图 8）。众所周知，血管生成会影响成骨，在新的骨形成过程中，特别是在临界尺寸的缺损中，骨祖细胞和成骨细胞靠近血管内皮细胞。血管内皮生长因子（VEGF）是血管生长的主要生长因子，在骨骼修复/再生过程中需要有效地将血管生成与成骨结合起来。

图8
 

已经探索了在工程支架中开发合适的血管网络的各种策略，即：i）在支架设计中使用生物相容性材料；ii）如第5节所述，支架的微纳结构，形态，孔隙率和粗糙度 ；iii）离子掺杂材料；iv）添加血管生成生长因子（例如，VEGF和成纤维细胞生长因子（FGF））或重组蛋白；v）在静态和动态条件下共培养细胞系统（表 3）。

                                                                                                表3. BTE的血管化策略

图9
 

据报道，使用低温3D打印技术制造包含水/ PLGA /二氯甲烷（DCM）乳状油墨支架的β-TCP和成骨肽（OP）作为BTE的血管化方法。然后将支架涂上含有I型胶原水凝胶的血管生成肽（AP），以确保血管生成能力（图 10A）。培养3天后，使用接种在支架上的大鼠内皮细胞（EC）进行的体外血管生成测试显示，活细胞的存活率为98％（图 10B - a，b）。还观察到在含有AP，支架的提取物增强的EC迁移，由于其快速释放（图 10B -c，d）。

图10

涉及在材料中掺入生物活性离子（例如，Mg，Ce和Cu）的策略导致血管生成和成骨标记物水平增加。Gu等。制备了掺有Mg的β-TCP支架，该支架与人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养，以实现骨形成和良好的血管形成潜力。此外，马等。报道了掺镁的3D打印钽支架上血管化骨形成的显着改善。另一种报道的方法是将Ce纳米颗粒掺入通过电纺丝获得的PLLA /明胶复合支架中。小鸡胚胎绒膜尿囊膜（CAM）作为用于血管生成评估的体内模型系统显示，当用VEFG治疗时，胚胎血管显着增加。传递在血管生成和成骨中起关键作用的生物活性离子的另一种方法是使用生物活性玻璃生物材料支架。在网络溶解过程中，生物玻璃化学结构中存在的离子的释放可以激活与血管形成和骨形成相关的不同基因。

血管生成细胞与多能干细胞的共培养对新血管的形成和成骨具有积极作用，这是另一种血管形成策略。例如，He等人。观察到，ASC /内皮祖细胞（EPC）共培养系统与HAp支架相结合可显着促进临界尺寸骨缺损的再生和血管生成。在Honda等人的一项研究中，在HUVEC和MC3T3-E1细胞共培养的条件下，结合结缔组织生长因子（CTGF）的HAp纤维支架通过刺激血管生成而增强了成骨作用。Thrivikraman等。开发了一种充满细胞的胶原蛋白水凝胶，封装了HUVECS和BMSC的共培养物，能够刺激hMSC的成骨分化，同时能够在体外和体内形成hMSC支持的血管毛细血管。Markou等。使用嵌入胶原蛋白/纤维蛋白原/纤连蛋白水凝胶中的内皮细胞，平滑肌细胞和周细胞（血管类器官）制造血管化组织，可用作体外萌发的毛细血管状结构的起点和快速创建功能性血管网络体内。

使用PCL纳米纤维（NFM）设计了另一种旨在复制自体血管化BTE的策略，该PCL纳米纤维的表面包含结合的内源性骨形态发生蛋白-2（BMP-2）和VEGF。Chick CAM体内试验显示，植入7天后，在含有内源性VEGF（VEGF和BMP2 | VEGF）的系统中形成具有高度分支的毛细血管网的高度成熟的血管（图 11）。

图11

骨组织工程中的7种免疫调节支架

具有调节具有免疫调节特性的宿主对支架免疫应答能力的支架可以在不同程度上利用再生潜能。免疫细胞的激活在调节病理状态下骨骼重建和吸收的平衡方面很重要。在免疫细胞中，巨噬细胞负责吞噬和募集其他在组织愈合过程中至关重要的细胞。

生物材料的物理化学特性，例如形状，大小，孔隙率和化学功能性，以及生物材料的类型，可以刺激免疫或炎症途径，并最终促进新骨的形成。Wang等。制备的掺有镧（La）的磁性镧（HA）纳米粒子/壳聚糖支架（MLaHA/CS）能够募集大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSC）并通过巨噬细胞极化调节宿主对支架的免疫反应，以实现骨骼再生。支架呈现出具有板状纳米粒子的相互连接的大孔，宽约50-150 nm，厚约30 nm。观察到磁性纳米粒子和La掺杂剂可以抑制巨噬细胞向M1的分化，从而降低炎症反应并促进M2巨噬细胞极化，从而为骨修复提供促进再生的微环境(图 12A))。与其他组合物相比，在大鼠颅骨缺损模式下进行的体内测试显示，MLaHA / CS组的新骨形成高（图 12B）。

图12

另一个有趣的方法是使用基于CaPs的生物材料来触发所需的免疫反应并增强骨骼愈合，这主要归因于CaPs的骨传导能力。此外，所述帽结构特征可强烈影响特定细胞应答。例如，纳米级缺钙HAp（CDHA）可以刺激成骨，而高孔隙度可以正向调节其炎症能力。此外，将CaP与MSC结合可以突出宿主免疫系统对骨骼再生的主要作用。另一方面，与CDHA生物材料相比，接种巨噬细胞的β-TCP表现出减少的促炎细胞因子。最近，有人提出了一种支架策略，该策略包括用能够调节骨骼生物学反应的生物活性离子功能化的β-TCP。例如，由β-TCP的生物复合材料掺杂有锰2+，锌2+，和/或Sr 2+结合SF根据特定离子掺杂剂呈现生物反应。而Sr 2+和Mn 2+掺杂显示出高成骨性，掺杂Zn 2+的支架增强了细胞增殖，因此显示出促进免疫调节的能力。

结论和未来展望

显然，传统的和最先进的组织工程手段在BTE中都具有潜力。最佳的制造方法必须能够生产能够满足所需组织特征（即结构稳定性-孔隙度，孔径和孔隙互连性，机械性能，生物相容性，骨电导/骨诱导性和血管生成潜力）的复合支架。仍然是一个挑战。仅注意这些关键特性和制造方法之间的关系，才有可能开发出具有与天然骨组织相同的分层结构的合适生物材料。

尽管适应和实现用于BTE的临床翻译的支架制造技术仍然是一个主要挑战，但临床上使用的支架数量非常有限。由于骨组织的复杂复合性质，使用单一材料的支架制造方法可能不会在BTE中占据领先地位。由于支架的结构特征严重影响机械和生物学性能，因此具有随机孔取向和缺乏孔控制的加工将不适用于要求苛刻的应用，例如大骨置换。此外，现在清楚的是，将受控的分层孔结构与定义的孔形状的互连孔网络相结合对于骨组织的制造至关重要。所以，磁共振成像（MRI），计算机断层扫描（CT）和微型CT扫描技术的进步导致了患者特定结构信息的可能性，这些信息可以反馈到支架设计环中并用于监测术后结构变化。通常，基于AM的技术能够通过利用数字孪生子（CAD模型）紧密生成所需的支架架构。当前，跨其他技术的结构和分辨率缺陷归因于硬件内的物理限制。

尽管这种方法对于诸如静电纺丝这样的技术仍然是新颖的，但它突出了基于AM的方法的基本原理的好处。但是，在复杂的基于过程的相互作用中控制纤维直径，例如搅动幅度，静电力，此外，将CAD与统计技术和有限元分析（FEA）结合使用可以进一步了解结构与机械性能之间的关系。虽然基于挤压的增材制造系统最有可能复制具有预定义内部几何形状的结构，但由于系统的物理限制（例如，喷嘴直径和运动控制），它们速度慢且打印分辨率差。克服这些局限性对于BTE的发展至关重要，候选方法可能将包括技术组合。细胞活力和营养素在整个结构中的灌注将需要新的生物墨水，而微载体的掺入将显示出希望。基于聚合的制造方法（例如SLA）可以克服分辨率和速度问题；然而，在考虑本文概述的特性的同时，必须开发新材料。在支架制造中使用的不同生物材料的集合中，聚合物和无机材料的组合被认为是最有前途的。这些复合材料具有更好的强度，足够的生物降解性和免疫反应。

简而言之，要创建模仿天然ECM的骨组织，就需要在结构处理关系与同时进行的材料开发方面做出进一步的努力。由于提到的有关不同制造技术的固有局限性，组合策略提供了潜力。增材制造技术与最新的医学成像技术相结合，在未来几年中具有巨大的潜力，可以将特定于患者的解决方案从实验室带到床边，同时提高患者的治疗效果。

关于BTE中血管化和免疫调节的巨大挑战，已成功报道了几种诱导血管生成和成骨的方法。然而，组织工程化的血管化骨移植物在临床中的有效应用是非常有限的。应注意正确理解生长因子释放的动力学和局部生物力学环境。在这种情况下，支架开发过程中的工程梯度可以为BTE开辟新的可能性。

最后，应考虑采用具有免疫调节特性的仿生支架设计，以增强原位骨再生以改善临床效果。

参考文献

https://doi.org/10.1002/adfm.202010609（点击文末阅读原文查看英文原文）

文章来源：微信公众号  上普生物