无颗粒3D打印导电水凝胶可神经元生长和电生理记录

最近，伊利诺伊大学香槟分校Chen Wang博士/Ralph G. Nuzzo教授团队在《Advanced Functional Materials》上发表了题为3D ParticleFree Printing of Biocompatible Conductive Hydrogel Platforms for Neuron Growth and Electrophysiological Recording论文。他们论述了导电3D周期微支架是使用无颗粒直接墨水书写方法制造的，用作神经元生长和电生理记录平台。

聚（甲基丙烯酸2-羟乙酯）/吡咯油墨，然后进行吡咯的化学原位聚合，可以通过小至1 m的喷嘴进行水凝胶打印。这些导电水凝胶可对复杂的2D和3D结构进行图案化，并与测试细胞培养物具有良好的生物相容性（7天后的活力约为94.5％）。水凝胶阵列促进广泛培养的加州Ap脚踏板神经节神经元的神经突生长。该平台允许细胞外电生理记录稳态和刺激的电神经元活动。总而言之，这种3D导电油墨打印工艺能够制备生物相容性和微米级的结构，以创建定制的体外电生理记录平台。

导电水凝胶的打印和表征
设计用于直接墨水书写的新墨水，使其能够制造具有细胞大小尺度特征尺寸的电生理凝胶平台。这种可打印材料由乙醇水溶液中各种分子量的pHEMA链与吡咯共聚单体的物理缠结聚合物网络组成。图1示意性地说明了这种成分和制造顺序，以获得导电凝胶支架。对pHEMA均聚物的含量进行了优化，以满足直接墨水书写的流变要求和适用于细胞培养研究的功能性凝胶复合材料的要求。聚合物网络设计在打印过程中将吡咯单体限制在水凝胶基质中，随后用氯化铁进行处理会引起原位聚合并掺杂生成的互穿聚吡咯。

在处理后数分钟内，打印的水凝胶从无色透明变为深黑色，可见聚合和掺杂。充分漂洗打印的图案，然后每4小时浸入去离子水中，每4小时进行4次水交换，以除去未反应的单体。由于这种微细加工工艺使油墨打印与原位导电颗粒形成分离，因此可以获得微米级的特征宽度。导电细丝的轻松，无堵塞挤压可实现复杂的3D结构形成（如图2所示）。

图1 不含导电颗粒的水凝胶的形成示意图。顶行表示打印结构的宏观视图，而底行表示水凝胶形成三个阶段的精细结构。下排图片中的绿线表示聚HEMA链，黄色三角形表示吡咯单体，棕点表示吡咯低聚物，黑点表示聚吡咯颗粒。

图2 水凝胶油墨的特性包括其流变行为和形成稳定结构的能力。a）墨水存储模量（G'）和损耗模量（G''）在1Hz频率下以振荡模式在1Hz下测量，显示出墨水具有类似液体的响应。b）测得的油墨粘度是剪切速率的函数，并显示了3D打印所需的剪切稀化特性，黑线显示了剪切稀化指数。c）使用1 m尖端打印的图案的透射光光学显微镜图像证明了使用小喷嘴进行可行的打印。d）打印的3D金字塔结构图像显示墨水具有出色的3D可构建性，单丝用箭头标记。

流变性质是影响3D微结构打印的重要因素。此处，油墨的流变功能和打印结构的示例如图2所示。在流变学表征期间，水凝胶油墨处于水合状态，使用水和乙醇的溶剂阱来防止测量过程中的蒸发。优化了pHEMA-吡咯水凝胶油墨的弹性模量和粘滞模量，使油墨丝能够跨越底层的缝隙，同时保持其形状。

由打印的丝状（脱水）结构制成的SEM分析（图3a，b）揭示了固化步骤形成的PPy的一般形态特征；这些显微照片揭示了一个紧密渗透的纳米颗粒网络（图3c，d）。pHEMA丝状网络形成了更加分散的基质，该基质在物理上限制了复合材料水合状态下的这种密集的纳米粒子种群。从结构的高放大倍数俯视图判断（图3c），与纯pHEMA薄膜和打印结构形成的边界相比，这些纳米粒子使复合材料的表面明显更粗糙。细丝结构的高分辨率横截面SEM图像表明，在细丝的整个内部域中都存在直径≈100nm的PPy纳米颗粒（图3d）。

图3 印出的“ I”图案的宏观和SEM图像包括：a）印出的图案具有1 mm比例尺的照片，b）从（a ）用400 m的比例尺，c）用100 nm的比例尺放大（b）中描绘的单条打印线的突出显示区域的图像，以及d）导电水凝胶图案的横截面的SEM图像，其中 500 nm比例尺。

将使用电化学工作站测量的复合水凝胶的电导率与四点探针测量的结果进行比较（图4a）。通过在PBS缓冲液中对Ag/AgCl进行多次CV扫描来探索水凝胶的电化学稳定性，如图4b所示。复合水凝胶的电容行为和法拉第电流有助于提高电荷转移效率，并最终在设备/电池界面记录信号质量。作者还从宏观角度评估了材料作为电导体的性能（图4c，d）。在此，将复合水凝胶丝网打印并插入具有4.5 V LED光源和电源的电路中。该演示表明，当由5V DC施加的偏压供电时，打印的图案可以支持LED的发射。

图4 导电水凝胶油墨的电和电化学特性。a）导电水凝胶薄膜的阻抗幅度随频率变化的I-V曲线和波特图显示出固有电导率为13.59 S cm-1，归一化阻抗为8.4Ωcm2。b）PBS缓冲液中的导电水凝胶薄膜相对于Ag/AgCl的CV扫描结果（20个循环，扫描速度20 mV s-1）显示聚吡咯的还原和氧化。c，d）当连接到以打印的水凝胶网作为导体并施加5V电压的电路中时，LED点亮。响应于所提供的功率，LED的照明和变暗证明了水凝胶网的导电性。

评价复合水凝胶的生物相容性
pHEMA和PPy都没有细胞毒性的报道，已被广泛用作各种生物分析应用中的活性和辅助材料。这里展示的是新复合材料的直接生物相容性测试结果，表明该材料可用作基底以支持培养中细胞正常生长的模式，甚至促进有用形式的细胞从玻璃基底迁移并附着在打印导电丝上。在这些实验中（图5），将设备灭菌后，将MC-3T3-E1前成骨细胞接种到带有打印U型复合细丝的导电水凝胶薄膜或载玻片上（图5a-d），如实验中所述部分。在7天的培养期内，使用活/死分析评估了薄膜支持的培养物上的细胞活力，并在第1、3和7天对死（红色）和活（绿色）细胞进行计数（图5b，e） 。

图5 导电水凝胶的生物相容性评估显示出高存活率并促进细胞迁移。a）在水凝胶薄膜上进行的细胞培养实验方案，其中b）在导电水凝胶薄膜上培养7天并用活/死分析法染色的成骨细胞的荧光图像。活细胞呈现绿色，呈死红色。c）培养的细胞迁移到打印出的U形导电图案上的方案，其中d）培养7天后细胞迁移到打印的细丝上的荧光图像，箭头表示迁移方向。e）在第1、3和7天，水凝胶薄膜上的成骨细胞的存活率。f）导电水凝胶的表面电荷测量，以及在无聚吡咯的pHEMA水凝胶（黑色）和导电水凝胶（红色）的PBS缓冲液中的参比。

用于单个培养的神经元电生理记录的基于导电墨水的平台
墨水的电导率和生物相容性允许制造电生理记录平台，用于研究培养的神经元的电活动（图6a）。图6b描述了在记录之前单元与打印阵列的两种类型的交互。这些代表性的数据显示了优选与阵列的复合水凝胶材料进行最大程度接触的细胞相互作用的行为：较小的细胞倾向于以阵列细丝的顶部为中心，而较大的细胞更常见地跨越两个相邻的阵列细丝。

像成骨细胞一样，培养基中存在的带正电的表面也不会抑制细胞附着，因此不需要额外的表面处理。图6c显示了从记录和刺激组及其相应的控制设备获取的电生理记录。与之形成鲜明对比的是，来自记录和刺激组的信号显示了动作电位，具有来自记录和刺激实验的代表性单个尖峰（图6d）。神经元与阵列的长期相互作用（图6e）突出显示了导电水凝胶的生物相容性，在培养5天后，神经元沿阵列的细丝大量向外生长。